Вакцина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом
В Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН разработана первая в России вакцина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) «КомбиГЛПС-Вак», которая в своем составе содержит антигены двух серотипов хантавирусов Пуумала и Добрава. «Комби-ГЛПС-Вак» — это бивалентная, цельновирионная, инактивированная, концентрированная, сорбированная вакцина. Субстратом для накопления хантавирусов является перевиваемая линия клеток Vero (культура клеток почек африканской зеленой мартышки). В ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» проведена аттестация методов лабораторного исследования экспериментальных серий вакцины.
Возбудителем ГЛПС является вирус семейства Bunjaviridae (входит в состав рода Hantavirus). К настоящему времени известно около 30 генетически различных серотипов хантавирусов. На территории Российской Федерации установлена циркуляция четырех хантавирусных серотипов: Хантаан, Пуумала, Сеул, Добрава. Резервуаром вируса «Хантаан» на Дальнем Востоке является полевая мышь, в Европейской части Российской Федерации резервуаром вируса «Пуумала» является рыжая полевка. Человеку вирус передается чаще всего воздушно-капельным путем [1].
Наиболее эффективным и надежным методом профилактики ГЛПС является вакцинация населения, проживающего в районах, неблагополучных по геморрагической лихорадке. К настоящему времени вакцины против хантавирусов применяются для вакцинации населения в Южной Корее, Китае и Японии. Вакцины приготовлены на основе хантавируса серотипа Хантаан, распространенного на Дальнем Востоке. Эти препараты не обладают защитным действием против хантавируса серотипов Пуумала и Добрава, распространеных в Европейских регионах России. Цель данного исследования —изучение экспериментальных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» на соответствие требованиям, предъявляемым к сорбированным инактивированным вирусным вакцинам.
Материалы и методы
«Комби-ГЛПС-Вак» — вакцина против ГЛПС бивалентная, культуральная, инактивированная формалином, концентрированная, очищенная, сорбированная. Вакцина содержит антигены двух серотипов хантавирусов Пуумала и Добрава; титр вакцинного антигена в ИФА не менее 1:128, стабилизатор — альбумин человека донорский не более 0,1 мг/мл, сорбент — алюминия гидроксид 1,0+0,5 мг/мл.
1.0. Метод определения специфической безопасности вакцины
Для изучения специфической безопасности вакцины использовали: тест-культуру Vero E6 (перевиваемая линия клеток почек африканской зеленой мартышки), которая наиболее чувствительна к хантавирусам Пуумала и Добрава. Проводили по три последовательных пассажа материала, приготовленного из смеси 5 ампул исследуемой серии вакцины, с инкубацией 7-8 сут при температуре инкубации тест-культуры. Для последующего потенциального выявления инфекционных фокусов (ФОЕ) вируса ГЛПС использовали метод ИФА, с применением конъюгата — протеин А, меченый пероксидазой хрена.
Выявление темно-серых пятен (инфекционных фокусов вируса ГЛПС) свидетельствовует о наличии не инактивированного вируса ГЛПС в вакцине. Согласно требованиям проекта НД испытуемая вакцина не должна содержать живого вируса ГЛПС — ФОЕ должны отсутствовать при просмотре тест-культуры.
2.0. Метод определения специфической активности вакцины против ГЛПС
2.1. Для определения титра хантавирусов Пуумала и Добрава в вакцине использовали метод ИФА. Все компоненты реакции ИФА готовили самостоятельно. Иммуносорбент получали следующим образом. На полистироловом планшете предварительно сорбировали:ИГ+ (мышиные моноклональные антитела Н6, специфичные к эпитопу нуклеокапсидного белка вируса Пуумала);ИГ– (мышиные иммуноглобулины класса IgG, не содержащие антител к хантавирусам).К+ (положительный контроль) — контрольный антиген, представляющий собой очищенный концентрат антигенов хантавирусов Пуумала и Добрава, полученных на культуре клеток Vero E6.
Конъюгат — мышиные моноклональные антитела А4, специфичные к эпитопу нуклеокапсидного белка вируса Добрава, меченные пероксидазой хрена.
Результат учитывали при сравнении оптических плотностей в лунках, положительными считали те образцы, для которых показатель оптической плотности в лунке с ИГ+ превышал показатель оптической плотности в лунке с ИГ- в 2,1. Титр антигенов хантавирусов Пуумала и Добрава в вакцине должен быть не менее 1:128.
2.2. Метод определения специфической активности (иммуногенности) вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» Для этой цели использовали: Опытная группа — мыши линии Balb/С в количестве 8 голов массой 18–20 г, которых иммунизировали внутримышечно по 0,5 мл вакцины 3-кратно с интервалами 2 недели.
Контрольная группа — мыши линии Balb/С в количестве 8 голов массой 18–20 г, которым вводили суспензию алюминия гидроксида.
Взятие крови через 2 недели после 3-й иммунизации, с последующим приготовлением сывороток. Содержание антител в иммунных мышиных сыворотках определяли в реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток Vero E6 по снижению количества ФОЕ под воздействием специфических антител. Титр нейтрализующих антител к хантавирусам Пуумала и Добрава должен быть не менее 1:16.
3.0. Определение остаточной ДНК клеток Vero E6
Так как вакцина «Комби-ГЛПС-Вак» культуральная и субстратом для накопления хантавирусов Пуумала и Добрава служит перевиваемая линия клеток Vero E6, был разработан и аттестован метод определения остаточной ДНК клеток Vero E6. Определение проводили методом ПЦР в реальном времени. В качестве контроля использовали препарат геномной ДНК клеток Vero E6. Содержание ДНК культуры клеток Vero в вакцине должно быть не более 10 нг/мл, что соответствует требованиям ВОЗ.
Помимо указанных выше тестов, лабораторные серии были изучены по всем показателям оценки качества вирусных инактивированных сорбированных вакцин: описание, бактериальная стерильность, время седиментационной устойчивости, размер частиц, извлекаемый объем, пирогенность, аномальная токсичность, бактериальные эндотоксины.
Результаты и обсуждение
Согласно требованиям ВОЗ (серия № 848 технических докладов, 1994) при создании вакцины против ГЛПС должны быть определены требования на стадиях изготовления: к культуре клеток, используемой для накопления вируса; к антигенной активности вируса и методам инактивации; стерильности.
К готовой вакцине предъявляются требования по следующим показателям: стерильность, безопасность, идентичность, содержание белка, специфическая активность, стабильность, пирогенность, БСА, безопасность, содержание адъюванта; маркировка; упаковка.
Культура клеток Vero E6 (перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки) — субстрат для накопления хантавирусов Пуумала и Добрава, была исследована по всем показателям, предъявляемым ВОЗ к клеточным культурам (стерильность, туморогенность, отсутствие посторонних вирусов и микоплазм), в том числе исследована на отсутствие цирковирусов свиней. На основании полученных результатов культура клеток Vero E6 была аттестована и разрешена для производства вакцины.
В ФГУН ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН получена молекулярно-генетическая характеристика вакцинных штаммов вирусов Пуумала (ПУУ-ТКД/VERO) и Добрава (ДОБ-ЕАТ/VERO), адаптированных и прошедших пассирование в культуре клеток Vero E6 (10 и более пассажей), в сравнении с прототипными исходными штаммами Пуумала (ТКД/Уфа-97) и Добрава (ЕАТ/Липецк-06). В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей и аминокислот S, М и L сегментов РНК штаммов вируса было установлено практически полное сходство вакцинного и исходного штаммов (всего 0,1–0,3% отличий), полные сиквенсы зарегистрированы в GenBank. Вакцинные штаммы ПУУ-ТКД, ГКВ № 1026, 12.2000 г. VERO и ДОБ-ЕАТ/VERO, ГКВ № 1027, 12.2000 г. депонированы в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.
При исследовании трех экспериментально-лабораторных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» по показателю специфическая безопасность инфекционных фокусов вирусов ГЛПС выявлено не было. Серии вакцины не содержат неинактивированного вируса.
Титр антигенов хантавирусов Пуумала и Добрава в 3 сериях вакцины составил 1:512.
Специфическая активность по титру вируснейтрализующих антител исследованных серий вакцины «КомбиГЛПС-Вак» в реакции нейтрализации (РН) составила 1:16, т.е. соответствовал требованиям проекта НД. Содержание остаточной ДНК культуры клеток Vero E6 в сериях вакцины составило не более 0,195 нг/доза.
На основании исследования 3 экспериментальных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» показано соответствие разработанной новой вакцины требованиям проекта НД (ФСП). Результаты приведены в таблице.
Вывод:
Проведенные исследования являются основанием для организации производства и выпуска эксперимен тальнопроизводственных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» и решения вопроса о возможности клинических испытаний новой вакцины.
Источник
По данным министерства здравоохранения Саратовской области на конец июня, с начала сезона 667 человек в регионе заразились геморрагической лихорадкой. Сейчас в стационаре с подозрением на это заболевание находится более двухсот человек. Зарегистрирован один летальный исход. Медики указывают на обострение ситуации с заболеваемостью с ГЛПC в этом году. Напомним, что из-за взлетевшей статистики властям пришлось перенести начало смены в оздоровительных детских лагерях, расположенных на Кумысной поляне, и провести обработку территории лесопарка фосфидом цинка (вещество относится к первому классу опасности). Впрочем, периодические повышения численности грызунов (ГЛПС в основном переносят рыжие мыши-полевки) можно переносить без огромного числа жертв и затрат. Речь идет о применении вакцины против вируса, которая разработана в России.
Федеральный Роспотребнадзор указывает на своем сайте, что в прошлом году в стране было официально зарегистрировано 5 855 случаев ГЛПС, в 2017-ом — 8298, в 2016-ом — 6 021. А всего, по данным ведомства, с 2000 по 2018 год было зарегистрирован 137 431 случай заболевания, в том числе 3 300 детей в возрасте до 14 лет. 570 случаев закончились летальным исходом.
Почти все заболевшие живут в Приволжском федеральном округе. Около 98% случаев заражений вызваны вирусом Puumula (Пуумала). Это один из нескольких существующих вирусов ГЛПС (его и разносят рыжие мыши-полевки).
Именно по этой причине, в частности, нельзя заимствовать существующие китайские и корейские образцы вакцин — они «работают» против других разновидностей вирусов ГЛПС — Hantaan (Хантаан) и Сеул, распространенных на тех территориях и встречающихся на российском Дальнем Востоке.
В России разработкой вакцины занимается Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН. В начале 90-х годов сотрудники учреждения участвовали в разработке одной из комбинированных вакцин для вирусов Пуумала и Хантаан совместно со специалистами из Южной Кореи. Однако, разработанный препарат оказался недостаточно эффективным. При этом выяснилось, что бивалентная — то есть, составленная против двух вирусов вакцина, является эффективнее моновалентной.
Работы продолжались, и в 2011 году в журнале «Биопрепараты» вышла статья «Вакцина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом». Авторы материала рассказывали о разработанной бивалентной вакцине «Комби ГЛПС — Вак» против вирусов Пуумала и Добрава (еще один вирус ГЛПС, встречающийся в европейской части страны, но значительно реже первого).
Три экспериментальные серии этой вакцины, по словам авторов, хорошо показали себя в ходе лабораторных испытаний на соответствие требований, которые предъявляются к подобным препаратам. Был сделан вывод о необходимости выпуска экспериментально-производственных серий вакцины, а также решении вопроса о проведении клинических испытаний.
Мы обратились Центр им. Чумакова с запросом о судьбе разработки. В ответе за подписью главы научного направления Центра доктора медицинских наук, профессора Евгения Ткаченко отмечается возрастающая значимость проблемы — тенденции к снижению заболеваемости ГЛПС нет, приводится статистика о более, чем 100 тыс. заболевших в нынешнем веке и констатируется необходимость разработки технологии изготовления вакцины.
Ученым института удалось впервые в мире разработать технологию изготовления и методы контроля тривалентной вакцины для противодействия вирусам «мышиной лихорадки» в Европейской России и на Дальнем Востоке. О каких именно видах вируса идет речь, не уточняется, но можно предположить, что это те из них, что входили в предыдущие образцы — Пуумала, Хантаан и Добрава. Отмечается, что вакцина может быть использована для профилактики ГЛПС не только в России, но также в странах Европы и Азии.
Увы, до реального применения этой уникальной разработки еще довольно далеко. Она пока даже не прошла стадию доклинических испытаний. А затем предстоят еще три фазы клинических испытаний. Последняя из них, когда с участием специалистов сравнивают заболеваемость среди привитых и непривитых добровольцев — чрезвычайно дорогостоящая. Именно после ее прохождения препарат можно регистрировать.
Центр «не в состоянии покрыть расходы на проведение клинических испытаний вакцины против ГЛПС и вынужден искать источники дополнительного финансирования» — говорится в письме.
Сколько нужно денег
На этот вопрос трудно дать ответ. Видимо, поэтому в письме, присланном нам, никаких даже приблизительных цифр указано не было. По данным за 2017 год, средняя стоимость фаз клинического исследования одного препарата составила $3,4 млн для первой фазы, $8,6 млн для второй и $21,4 млн для третьей. То есть, цена всех трех фаз превысила $30 млн. Эти цифры, возможно, справедливы для зарубежных стран. В 2012 году стоимость исследования в России оценивалась в $1,3 млн. Такая сумма, наверняка, значительно ближе к истине. Например, в 2017 году Федеральное медико-биологическое агентство оценивало стоимость клинических исследований «Белка теплового шока» — российского лекарства для лечения злокачественных опухолей — в сумму более 100 млн рублей. Хотя, повторимся, точную цифру для вакцины, защищающей от ГЛПС (речь об образце не имеющем мировых аналогов), мы можем только предполагать.
Во что нам обходится мышиная лихорадка?
Сумма даже в 100 миллионов рублей выглядит значительной для научно-производственной организации. Но много ли это на фоне ежегодных экономических потерь, наносимых ГЛПС? Лихорадка, по подсчетам ученых, в 85% случаев поражает мужчин от 20 до 40 лет — одну из самых трудоспособных групп населения страны. Авторы статьи о технологии производства вакцины указывают, что затраты на лечение одного больного составляют 60-90 тыс. руб. (данные 2015 г.) . То есть, при 10 тыс. заболевших в стране в год они составят 600-900 млн. рублей. Сюда же стоит добавить ежегодные расходы в 15-20 млн. руб. на дератизацию (борьбу с грызунами) в каждом из, как минимум, 30 регионов страны, которому угрожает ГЛПС.
При этом стоимость дозы вакцины на тот же 2015 год составляла примерно 200 рублей. Или 700 рублей для трехкратной вакцинации одного человека, которая должна полностью защитить от болезни. Выходит, что довести до конца уникальную разработку выгоднее экономически.
По мнению Евгения Ткаченко, проблему надо решать «комплексно, на государственном уровне, включая разработку вакцинопрофилактики ГЛПС».
Автор: Сергей Алдаркин
Источник