Генная терапия при синдроме ушера

Введение

Синдром Ашера (Usher syndrome, USH) является аутосомно-рецессивным заболеванием, на которое приходится почти половина всех случаев сочетанной наследственной глухоты и слепоты. По оценкам, распространенность USH составляет от 3,2 до 6,2 на 100 000 [1]. Тем не менее распространенность может быть до 1 на 6000. USH проявляется нарушением слуха, вестибулярной дисфункцией и пигментным ретинитом (RP) (синоним — тапеторетинальная абиотрофия сетчатки). В зависимости от возраста начала и тяжести клинических проявлений USH подразделяют на три основных клинических подтипа: USH1, USH2 и USH3. USH1 является наиболее тяжелой формой, наблюдающейся с рождения или с манифестацией до 5 лет, которая возникает в результате мутаций в любом из 6 генов: MYO7A, USH1C, CDH23, PCDH15, USH1G и CIB2. USH2 связан с мутациями в 3 генах: USH2A, ADGRV1 и DFNB31. USH3 вызван мутациями в гене CLRN1. Недавно был выделен 4-й атипичный USH, который возникает в результате мутаций в любом из генов: HARS, CEP250, PDZD7, C2orf71. На долю USH1 приходится около трети всех зарегистрированных случаев USH, на долю USH2 — две трети. USH3 протекает клинически наиболее благоприятно, встречается очень редко (~3%).

В течение последних нескольких лет были предприняты значительные усилия для описаний молекулярных характеристик, спектра мутаций и диагностики USH в различных популяциях, в т. ч. в испанской [2], американской [3], европейской [1], датской [4], финской [5], британской [1], алжирской [6], итальянской [7], немецкой [8], арабской [9], африканской [6] и китайской [10]. Современные методы секвенирования следующего поколения (next generation sequencing — NGS) значительно улучшили эффективность молекулярной характеристики в USH [1, 3, 11–13]. Кроме того, традиционный метод Сэнгера и метод мультиплексной амплификации (Multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA) успешно применяются для выявления глубоких интронных мутаций, больших делеций/дупликаций и вариаций числа копий генов (copy number variation — CNV).

Работы, в которых были представлены молекулярный профиль пациентов при центральных дистрофиях сетчатки в российской популяции [14] и генотип/фенотип корреляции в единичных клинических случаях пациентов с USH [15], уже были опубликованы авторами. Тем не менее нет опубликованных данных по USH в российской когорте в соответствии с утвержденным протоколом клинических исследований.

Цель исследования: изучить спектр мутаций российской когорты пациентов с USH в рамках наблюдательного исследования NCT03319524 [16] и провести анализ метаболома и интерактома, а также патогенетических путей развития USH для поиска путей таргетного лечения.

Материал и методы

28 пациентов из группы 3214 пациентов (11 мужчин, 17 женщин; возраст — 47,6±12,7 года; возрастной диапазон проявления заболевания — 0–18 лет) с наиболее выраженными клиническими симптомами USH (нейросенсорная тугоухость 3–4 степени и сужение полей зрения до 5–15 градусов) были приглашены к участию. Национальный состав группы: 21 пациент (75%) — русские, 3 (10%) — украинцы, 2 (7%) — евреи, 1 (4%) — белорус и 1 (4%) — чуваш. Письменное информированное согласие было получено у всех 28 пациентов, исследование было одобрено Независимым международным этическим комитетом (Москва).

Клиническое обследование: каждому пациенту проводилась биомикроскопия, периметрия, визометрия, оптическая когерентная томография (ОКТ), офтальмоскопия с фоторегистрацией, электроретинография (ЭРГ), запись зрительно вызванных потенциалов, 32-оттеночный цветотест Хью, тональная и электронная аудиометрия, измерение акустического импеданса, вестибулометрия, электронистагмография и постурометрия. Молекулярно-генетическое подтверждение клинического диагноза выполнено методом высокопроизводительного параллельного секвенирования ДНК. Был проведен подробный компьютерный анализ патогенетических путей развития клинической картины у 20 пациентов с подтвержденным диагнозом USH. Использовалось программное обеспечение HGVS, Genemap, Genemania, CLINVAR, Genego, STRING, Cytoscape и база данных консорциума EMBL для моделирования интерактома и анализа полученных данных.

Результаты и обсуждение

Частота обнаруженных мутаций в обследованной когорте пациентов составила: 50% в гене USH2A, 39% — MYO7A, 5% — PCDH15, 3% — USH1C, 3% — CDH23, характеристика которых представлена авторами ранее [17] (табл. 1). Для обсуждения терапевтических подходов к коррекции утраченных или недостаточных функций генов в данной группе пациентов необходимо изучение и сопоставление всех факторов, которые влияют на патогенез заболевания, в т. ч. учет молекулярно-генетических факторов и факторов внешней среды: (геном —> транскриптом —> протеом —> метаболом), в совокупности образующих интерактом, которые определяют фенотип того или иного пациента [18]. Регуляции метаболизма в сетчатке обеспечиваются:
1) количеством ферментов в зависимости от активации или ингибирования транскрипции и синтеза белков; 2) каталитической активностью ферментов, что контролируется аллостерическими модуляторами, активаторами, конкурентными ингибиторами (т. е. агонистами и антагонистами) и посттрансляционными модификациями, такими как фосфорилирование, ацетилирование и гликозилирование под контролем гормонов, ростовых факторов и нейротрансмиттеров; 3) субстратной доступностью (концентрацией), которая зависит от систем активного мембранного транспорта (помпы, транспортеры, требующие затрат энергии) и пассивной диффузии через субстрат-специфические мембранные белки (ионные каналы), которые контролируются концентрационным градиентом. В процессе фототрансдукции происходит передача зрительного сигнала, начиная с захвата фотонов сетчаткой глаза и завершая формированием зрительных образов в зрительной коре головного мозга. Подробнее о геномном контроле фототранс­дукции можно узнать, изучая функцию каждого из белков фототрансдукции, транслируемых с указанных генов, сначала по отдельности, а затем собирая в одну общую сеть интерактома. Изучение интерактома, т. е. полного набора взаимодействий между молекулами в отдельной клетке, как непосредственных физических контактов между белками (белок-белковые взаимодействия), так и непрямых взаимодействий генов (например, эпистаз, ап-регулирование, ко-активация, влияние факторов транскрипции и пр.), позволяет выделять наиболее перспективные терапевтические мишени. В то время как данные об экспрессии матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) генов и данные протеомного анализа не раскрывают полностью всего того, что может происходить в клетке, метаболические профили (изучение метаболома сетчатки) [19, 20] могут дать мгновенный снимок физиологических процессов в клетке. Одна из задач современной медицины, системной биологии и функциональной геномики — это интегрирование данных протеомики, транскриптомики и метаболической информации для получения более целостного представления о строении и функции сетчатки у конкретного пациента. При компьютерном анализе и изучении взаимодействия наиболее активных генов метаболизма сетчатки при USH в изучаемой когорте выяснилось, что в 67% случаев наблюдается физическое взаимодействие генов, в 13% — ко-экспрессия, в 6% — ко-локализация, в 4% — совместные метаболические пути, в 1,4% — генные взаимодействия, 0,59% имеют общие белковые домены. В 6% случаев взаимодействие генов или белков, синтезируемых с этих генов, не доказано, но по некоторым предсказательным алгоритмам их взаимодействие вероятно.

Анализ интерактома (рис. 1) показывает, что у протокадгерина (PCDH15) большая сеть контактов с кадгеринами (CDH23), у ушерина (USH2A) — с разными видами коллагенов (COL4A3), у миозина (MYO7A) — с вирлиновым комплексом (WHRN) и различными подвидами актина (ACTA2, ACTG2). Примечательно, что MYO7A взаимодействует с гармонином, что позволяет предположить, что он может участвовать в закреплении верхнего конца цилии стержня фоторецептора (видоизмененные реснички). MYO7A также взаимодействует с некоторыми сплайс-формами протокадгерина (PCDH15), предполагается, что этот моторный белок может участвовать в формировании комплексов на обоих концах реснички (рис. 2).

MYO7A — ген, кодирует одну из форм белка миозина, расположен на 11-й хромосоме и имеет 55 экзонов. Миозин действует как моторный белок, управляемый АТФазой, для транспорта меланосом и фагосом вдоль нитей актина в пигментном эпителии сетчатки, а также для транспорта опсина и других белков фототрансдукции в фоторецепторах. Мутации в гене MYO7A вызывают тяжелую и глубокую непрогрессирующую нейросенсорную тугоухость, пигментный ретинит до начала подросткового периода и часто с вестибулярной арефлексией. Острота центрального зрения обычно лучше, чем 0,3, в первые два десятилетия жизни. Поля зрения у пациентов с USH1B начинают сужаться в средней периферии и переходят к остаточным небольшим центральным островкам с небольшими участками периферических полей зрения на самых поздних стадиях заболевания. Офтальмоскопически у пациентов наблюдаются стушеванность артерий и атрофия ретинального пигментного эпителия (РПЭ) с пигментацией по типу «костных телец». Аутофлуоресценция глазного дна может показать кольцо гипер­аутофлуоресценции в макуле. ОКТ часто выявляет потерю наружных слоев сетчатки и присутствие кистозного макулярного отека. Ганцфельд-ЭРГ почти всегда нерегистрируемая или амплитуды сигналов сильно снижены.

В сетчатке большая часть молекул миозина MYO7A находится в пигментном эпителии сетчатки (РПЭ), где происходят многие реакции зрительного ретиноидного цикла. V.S. Lopes et al. наблюдали [21], что сетчатка с мутациями в MYO7A устойчива к острому световому повреждению по причине более низкого уровня RPE65, изомеразы RPE, которая играет ключевую роль в ретиноидном цикле. Было показано, что RPE65 обычно подвергается светозависимой транслокации, чтобы стать более сконцентрированным в центральной области клеток RPE. Эта транслокация требует участия моторного белка MYO7A, поэтому при мутациях в гене MYO7A RPE65 частично локализован на свету и распадается быстрее, возможно, из-за его неправильной локализации, что дает правдоподобное объяснение его более низким уровням. После 50–60% фотозасвета сетчатка с мутацией в MYO7A демонстрирует повышенные уровни всех трансретиниловых эфиров на начальных стадиях темнового восстановления, что согласуется с дефицитом активности RPE65. Наконец, MYO7A и RPE65 совместно иммунопреципитируются из клеточного лизата RPE антителами против любого из белков, и два белка были локализованы в одних и тех же участках клетки, что указывает на их прямое или косвенное взаимодействие. Вместе результаты подтверждают роль MYO7A в транслокации RPE65, иллюстрируя участие молекулярного мотора в пространственно-временной организации ретиноидного цикла в процессе фототрансдукции [21].

На основе этих знаний можно предположить, что зарегистрированный и разрешенный к применению на территории США препарат Luxturna (воретиген непарвовек), представляющий собой рабочую копию гена RPE65 на аденовирусном носителе, в будущем может показать свою эффективность при терапии MYO7A, ассоциированного с USH1. Также разрабатывается генно-терапевтический препарат UshStat (компания Sanofi совместно с Oxford biomedica) с доставкой правильно работающей копии гена MYO7A на лентивирусном носителе [22–25], однако продвижения в этой области происходят относительно медленно, в т. ч. в связи с повышенной иммуногенностью лентивирусной технологии доставки.

USH2A — ген, кодирующий белок ушерин, расположен на 1-й хромосоме и имеет 72 экзона. Ушерин содержит участки ламинина эндотелиального ростового фактора, домен пентаксина и множество участков фибронектина типа III, он находится в базальной мембране и важен для развития и поддержания гомеостаза внутреннего уха и сетчатки. Для этого гена было найдено несколько вариантов транскриптов, кодирующих разные изоформы белка. Мутации в гене USH2A являются наиболее частой причиной аутосомно-рецессивного несиндромального пигментного ретинита и USH2 в мировой статистике, однако в нашей группе пациентов в связи с особенностями формирования когорты (по критериям включения в группу принимались пациенты с наиболее серьезными нарушениями) большой процент составили пациенты с USH1. Никталопия и потеря периферического поля зрения в течение первых двух десятилетий, прогрессирующая с возрастом, наблюдались у пациентов с этим типом заболевания, хотя темпы прогрессирования варьировались с существенной внутри- и межсемейной фенотипической изменчивостью. Терапевтические подходы к коррекции недостаточной функции белка ушерина в связи с большим размером гена затруднены, однако разрабатываются различные подходы к доставке более длинных генов (так называемые наночастицы) и попытки замены частей гена (генная терапия мутаций в 13-м экзоне гена USH2A, разрабатываемая компанией ProQR), в т. ч. с применением технологии CRISPR [26]. Описание исследованной российской когорты пациентов с синдромом Ашера и частота мутаций в генах, наиболее частых при данном синдроме, представлены на рисунке 3 и в таблице 1.

PCDH15 — ген суперсемейства кадгеринов, кодирует один из подтипов протокадгерина, расположен на 10-й хромосоме и насчитывает 48 экзонов. Протокадгерины кодируют интегральные мембранные белки, которые обеспечивают кальций-зависимую клеточно-клеточную адгезию. Он играет существенную роль в поддержании нормальной функции сетчатки и кортиева органа. CDH23 вместе с PCDH15 образуют концевые звенья, которые соединяют стереоцилии, что крайне важно для поддержания жизнеспособности фоторецепторов и клеток кортиева органа. Мутации в этом гене приводят к потере слуха и развитию USH1. Характерен альтернативный сплайсинг, что приводит к появлению нескольких изоформ белка [27].

USH1C — ген ушерин 1С, расположен на 11-й хромосоме, имеет 29 экзонов. Этот ген кодирует белок-каркас, который участвует в сборке белковых комплексов. Белок содержит PDZ-домены, область сверхскрученной спирали с двойным сигналом ядерной локализации. Дефекты в этом гене являются причиной развития USH1C и несиндромальной нейросенсорной тугоухости аутосомно-рецессивного типа 18. Для этого гена было обнаружено множество вариантов транскриптов, кодирующих разные изоформы белка.

CDH23 — кадгерин-связанный белок 23-го подтипа, расположен на 10-й хромосоме, имеет 71 экзон. Этот ген также является членом суперсемейства кадгеринов. Белок с этого гена участвует в организации стереоцилий и формировании ресничек фоторецепторов. USH1D и несиндромальная аутосомно-рецессивная глухота DFNB12 вызваны аллельными мутациями этого кадгерин-подобного гена. Описаны альтернативные варианты сплайсинга, кодирующие разные изоформы этого белка [28].

Терапевтические подходы к коррекции функции генов USH1C, CDH23 и PCDH15 пока ограничиваются косвенными методиками — использованием аминогликозидов как ex vivo, так и in vivo для считывания преждевременных стоп-кодонов или нонсенс-мутаций [29]. Аминогликозиды в данном случае работают путем ослабления строгого механизма отбора рибосомой при синтезе белка из мРНК. Как при антибактериальном действии, когда они нарушают правильную генерацию полипептидов бактерий, так и в этом случае, расслабляя трансляцию, аминогликозид позволяет вставлять аминокислоту в область стоп-кодона вместо обрыва синтеза белка. Хотя эта аминокислота может быть не той аминокислотой, которая наблюдается в белке дикого типа, существует возможность восстановления правильной функции или по крайней мере лучшая функциональность получаемого белка ушерина, кадгерина или протокадгерина.

Заключение

Авторами изложены результаты наблюдательного клинического исследования NCT03319524 и проведен подробный компьютерныйанализ метаболома и интерактома, а также патогенетических путей развития USH в обследуемой когорте пациентов с обсуждением важности патогенетически направленных подходов к терапии и наиболее перспективных подходов к терапевтическому воздействию, в т. ч. с применением генной терапии.

Финансирование/Funding

Исследование спонсировано БФ «Фонд поддержки слепоглухих «Со-единение» и АНО «Лаборатория Сенсор-Тех».

Autonomous non-commercial organization Laboratory “Sensor technology for deafblind” and Deaf-Blind Support Foundation “Con-nection”.

Сведения об авторах:

1Иванова Марианна Евгеньевна — к.м.н., руководитель, ORCID iD 0000-0002-1089-4293;

2Атарщиков Дмитрий Сергеевич — к.м.н., врач-офтальмолог, ORCID ID 0000-0003-4401-9099;

3Демчинский Андрей Михайлович — к.м.н., руководитель медицинских проектов, ORCID iD 0000-0002-1689-9394;

4Стрельников Владимир Викторович — д.б.н., заведующий лабораторией эпигенетики, ORCID iD 0000-0001-9283-902X;

5Бар Дебмала — PhD, начальник отдела исследований
и разработки, ORCID iD 0000-0002-2557-7768;

6Порядин Геннадий Васильевич — д.м.н., профессор, член-корр. РАН, почетный заведующий кафедрой патофизиологии, ORCID iD 0000-0003-2010-3296;

7Балашова Лариса Маратовна — д.м.н., профессор, руководитель, ORCID iD 0000-0001-9349-7092;

6Салмаси Жеан Мустафаевич — д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патофизиологии, ORCID iD 0000-0001-8524-0019.

1НКЦ «Офтальмик», 125167, Россия, г. Москва, Ленинградский пр-т, д. 47/3–3.

2ФГБУ «ЦКБ с поликлиникой». 121359, Россия, г. Москва, ул. Маршала Тимошенко, д. 15.

3АНО «Лаборатория Сенсор-Тех». 115114, Россия, г. Мос­ква, Павелецкая наб., д. 2, стр. 3.

4ФГБНУ “МГНЦ”. 115478, Россия, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1.

5Центр геномики и прикладной генной технологии. 560032, Индия, г. Бангалор, ул. Чоланаяканахалли, д. 209.

6ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. 117513, Россия, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

7НП «МНПЦПТ». 119034, Россия, г. Москва, ул. Пречистенка, д. 29/14.

Контактная информация: Иванова Марианна Евгеньевна, e-mail: info@oftalmic.ru. Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах. Конфликт интересов: Иванова М.Е. является сотрудником НКЦ «Офтальмик». Остальные авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Статья поступила 07.05.2019.

About the authors:

1Marianna E. Ivanova — MD, PhD, Head of CRO, ORCID iD 0000-0002-1089-4293;

2Dmitry S. Atarshchikov — MD, PhD, ophthalmologist, ORCID iD 0000-0003-4401-9099;

3Andrey M. Demchinsky— MD, PhD, Head of Medical Projects, ORCID iD 0000-0002-1689-9394;

4Vladimir V. Strelnikov — PhD, Head of Epigenetics Laboratory, ORCID iD 0000-0001-9283-902X;

5Debmalya Barh — PhD, Head of R&D Department, ORCID iD 0000-0002-2557-7768;

6Gennadiy V. Poryadin — MD, PhD, Professor, Corresponding Member of RAS, Honorary Head of Pathophysiology Department, ORCID iD 0000-0003-2010-3296;

7Larisa M. Balashova — MD, PhD, Professor, Head of the Center, ORCID iD 0000-0001-9349-7092;

6Jean M. Salmasi — MD, PhD, Professor, Head of Pathophysiology Department, ORCID iD 0000-0001-8524-0019.

1LLC “Oftalmic”. 47/3–3, Leningradsky Prospekt, Moscow,125167, Russian Federation.

2Central Clinical Hospital for Presidential Affairs. 15, Marshala Timoshenko str., Moscow,121359, Russian Federation.

3Autonomous nonprofit organization “Scientific and industrial laboratory “Sensor technology for deafblind”. 2, bld. 3, Paveletskaya naberezhnaya, Moscow, 115114, Russian Federation.

4Research Centre for Medical Genetics. 1, Moskvorechie str., Moscow, 115478, Russian Federation.

5Institute of Integrative Omics and Applied Biotechnology. 209, Cholanayakanahalli str., Bangalore, 560032, India.

6Pirogov Russian National Research Medical University. 1, Ostrovityanov str., Moscow, 117513, Russian Federation.

7Non-profit partnership International Scientific and Practical Center for the Proliferation of Tissues of Russia. 29/14, Prechistenka str., Moscow, 119034, Russian Federation.

Contact information: Marianna E. Ivanova, e-mail: info@oftalmic.ru. Financial Disclosure: Marianna E. Ivanova is the collaborator of LLC “Oftalmic”. Other authors declare that there is no conflict of interests. Received 07.05.2019.